Alkalisk protease

Søknad og prinsipp

Denne alkaliske proteasen brukes til å bestemme proteaseaktivitet, uttrykt som PC-enheter, av preparater avledet fra Bacillus subtilis var. og Bacillus licheniformis var. Analysen er basert på en 30-minutters proteolytisk hydrolyse av kasein ved 37 ° og pH 7,0. Uhydrolysert kasein fjernes ved filtrering, og det oppløste kaseinet bestemmes spektrofotometrisk.

Reagenser og løsninger av alkalisk protease
Kasein Bruk Hammarsten-grade kasein (United States Biochemical Corp., katalognummer 12840, eller tilsvarende).
Tris Buffer (pH 7,0) Løs opp 12,1 g enzym (eller tilsvarende) tris (hydroksymetyl) aminometan i 800 ml vann, og titrer med 1 N saltsyre til pH 7,0. Overfør til en 1000 ml målekolbe, fortynn til volum med vann og bland.
TCA-løsning Løs opp 18 g trikloreddiksyre og 19 g natriumacetattrihydrat i 800 ml vann i en 1000 ml målekolbe, tilsett 20 ml iseddik, fortynn til volum med vann og bland.
Substratløsning Oppløs 6,05 g enzym-tris (hydroksymetyl) aminometan i 500 ml vann, tilsett 8 ml 1 N saltsyre og bland. Løs opp 7 g kasein i denne løsningen, og varm opp i 30 minutter i et kokende vannbad under omrøring.
Avkjøl til romtemperatur, og juster til pH 7,0 med 0,2 N saltsyre, tilsett syren sakte, under kraftig omrøring, for å forhindre utfelling av kasein. Overfør blandingen til en 1000 ml målekolbe, fortynn til volum med vann og bland.

Prøvepreparering ved hjelp av Tris Buffer, klargjør en løsning av prøveenzympreparatet slik at 2 ml av den endelige fortynningen vil inneholde mellom 10 og 44 bakterielle proteaseenheter.

Fremgangsmåte for alkalisk protease
Pipetter 10,0 ml av substratløsningen i hver av en serie med 25 - 150 mm reagensrør, slik at ett rør for hver enzymtest, ett rør for hvert enzymblank og et rør for et substratblank. Ekvilibrer rørene i 15 minutter i et vannbad opprettholdt ved 37 ° ± 0,1 °.
Starter stoppeklokken på null tid, pipetterer du raskt 2,0 ml av prøvepreparatet i det likevektede substratet. Bland, og sett ut rørene i vannbadet. Tilsett 2 ml Tris-buffer (i stedet for prøveutarbeidelse) til underlaget. Etter nøyaktig 30 minutter, tilsett 10 ml TCA-løsning til hver enzyminkubasjon og til substratblanket for å stoppe reaksjonen. Varm rørene i vannbadet i ytterligere 30 minutter for å la proteinet koagulere helt.
På slutten av den andre oppvarmingsperioden, rist hvert rør kraftig, og filtrer gjennom 11 cm Whatman nr. 42, eller tilsvarende, filterpapir, og kast de første 3 ml filtrat.
[Merk: Filtratet må være helt klart.]
Bestem absorbansen til hvert prøvefiltrat i en celle på 1 cm, ved 275 nm, med et passende spektrofotometer ved å bruke filtratet fra substratemnet for å sette instrumentet på null. Korriger hver avlesning ved å trekke riktig enzymavlesning, og registrer verdien som er oppnådd som AU.

Standardkurveoverføring 100,0 mg L-tyrosin, kromatografisk kvalitet eller tilsvarende (Aldrich Chemical Co.), tidligere tørket til konstant vekt, til en 1000 ml målekolbe. Oppløs i 60 ml 0,1 N saltsyre. Når den er helt oppløst, fortynn oppløsningen til volum med vann, og bland grundig. Denne løsningen inneholder 100 µg tyrosin i 1,0 ml. Forbered tre fortynninger fra denne stamløsningen for å inneholde 75,0, 50,0 og 25,0 µg tyrosin per ml. Bestem absorbansen til de fire løsningene ved 275 nm i en 1 cm celle på et passende spektrofotometer versus 0,006 N saltsyre. Forbered et plot av absorbans versus tyrosinkonsentrasjon.

Beregning av alkalisk protease
En bakteriell proteaseenhet (PC) er definert som den mengden enzym som produserer ekvivalent med 1,5 ug / ml L-tyrosin per minutt under analysens betingelser.
Fra standardkurven, og ved interpolasjon, bestem absorbansen til en løsning som har en tyrosinkonsentrasjon på 60 µg / ml. Et tall nær 0,0115 skal oppnås. Del den interpolerte verdien med 40 for å oppnå absorbansen som tilsvarer den for en løsning som har en tyrosinkonsentrasjon på 1,5 µg / ml, og registrer verdien som er avledet som AS.
Beregn aktiviteten til prøveenzympreparatet ved ligningen

PC / g = (AU / AS) × (22 / 30W)

hvor 22 er det endelige volumet i ml av reaksjonsblandingen; 30 er tiden, i min., For reaksjonen; og W er vekten, i g, av den opprinnelige prøven som ble tatt.

Emballasje og lagring av alkalisk protease

Emballasjepose for fast mat, 25 kg / fat.

Alkaline Protease skal oppbevares på tørre, kjøle og godt ventilerte steder borte fra sol, varme.

Innbetaling :T / T, Paypal, Western Union, Alibaba Trade Assurance, VISA, MasterCard, e-Checking, Pay Later, LC og etc.